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            遠慕分享:HRP標記抗體常用的方法

            2024-01-18 10:33 來源:上海遠慕生物試劑
            酶與抗體交聯的方法有許多種,根據酶的結構不同可采用不同的方法。對于制備HRP結合物,可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法更為常用。

            戊二醛二步法

            1.原理:戊二醛為一種雙功能試劑,通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。

            2.標記步驟:

            (1)稱取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室溫靜置過夜。

            (2)反應后的酶溶液經Sephadex G-25層析柱,用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1分鐘,收集棕色流出液。如體積大于5ml,則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中,緩慢攪拌。

            (3)將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml,攪拌下逐滴加入酶溶液中。

            (4)用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml,繼續攪拌3?小時。

            (5)加0.2M賴氨酸0.25ml,混勻后,置室溫2小時。

            (6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨,置4℃1小時。

            (7)3000rpm離心半小時,棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

            (8)將上述溶液裝入透析袋中,對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析,去除銨離子后(用萘氏試劑檢測),10,000rpm離心30分鐘去除沉淀,上清液即為酶結合物,分裝后,冰凍保存。

            3.結果判定:

            (1)定性及效價滴定:用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色,可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式實驗系統里)對酶結合物進行滴定( 見本節 (三)工作濃度的選擇)。

            (2)定量和克分子比值測定:可用分光光度計測定(光程25px)。

            酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4

            IgG量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62

            酶量(mg/ml) IgG量(mg/ml) 酶量
            克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 4
            40,000 160,000IgG量

            (3)本法標記步驟比較簡單,重復性好。缺點是酶的利用率低,一般只有2~4%的酶與蛋白質結合。

            4.試劑及器材:

            (1)0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS):取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml,NaCl1.8克,加蒸餾水至200ml。

            (2)1.25%戊二醛液:取25%戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。

            (3)1M PH9.5碳酸鹽緩沖液:取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。

            (4)0.2M賴氨酸溶液:稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。

            (5)0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。

            (6)PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。

            (7)萘氏試劑及聚乙二醇(PEG,MW2000)。

            (8)純化的特異性抗體或抗Ig抗體。

            (9)HRP(RZ>3.0)。

            (10) Sephadex G-25層析柱(50px×1250px)。

            (11) 攪拌器,分光光度計,離心機。

            (12) 透析袋,大、小燒杯,試管,吸管等。

            簡易過碘酸鈉法

            本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再與Ig上的氨基相結合,所獲酶標記抗體的產率高,將近70%的HRP和Ig結合,99%的Ig與酶結合,酶與Ig的活性無重大損失,是目前最常用的方法。

            1.原理:經典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP,從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連,形成斯夫氏鹼,后者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩定的酶標記抗體。

            2.標記步驟:

            (1)稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。

            (2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液,室溫下避光攪拌20分鐘。

            (3)將上述溶液裝入透析袋中,對1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析,4℃過夜。

            (4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液,使以上醛化桯RP的PH升高到9.0~9.5,然后立即加入10mg IgG(抗體,或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中,室溫避光輕輕攪拌2小時。

            (5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混勻,再置4℃2小時。

            (6)將上述液裝入透析袋中,對0.15M PH7.4 PBS透析,4℃過夜。

            其余步驟(純化)同戊二醛標記步驟的(6)、(7)、(8)。

            3.結果判定:

            除標記物IgG量的計算,略有不同以外,其余均同戊二醛法。

            IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62

            4.試劑及器材:

            (1)0.1M NaIO4:稱取241mg高碘酸鈉(廣州化學試劑廠,批號830602)溶于蒸餾水10ml中。

            (2)1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液:

            0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml

            0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml

            加蒸餾水至2,000ml。

            (3)0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液:

            Na2CO3 0.32克

            NaHCO3 0.586克

            加蒸餾水至50ml

            再用蒸餾水作20倍稀釋,即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。

            (4)NaBH4溶液(4mg/ml):

            臨用時稱取NaBH44mg溶于1ml蒸餾水中。

            (5)其它的試劑及器材可參見戊二醛標記法。

            (三)工作濃度的選擇

            在免疫酶技術中,首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化,便可導致試驗結果產生很大的波動。另外,由于濃度過高,可使非特異性反應增加,而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此,正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。

            酶標記抗體的滴定方法是:將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上,然后將經過一系列稀釋的酶標抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應,以酶與底物的顯色反應程度來確定酶標記抗體的效價,或稱工作濃度。

            其步驟為:先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右,于聚苯乙烯板孔內加0.1ml,4℃過夜,次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600……(根據據抗體的滴度而定),分別加入反應孔中,每個稀釋度二孔,每孔0.1ml,37℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液,每孔0.1ml,37℃10~30分鐘。以2M H2SO40.05ml終止反應。

            結果判定主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值。并以OD為縱座標,結合物濃度為橫座標,繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右,且曲線斜率最大時的酶標抗體稀釋度,即為該標記物的工作濃度。

            有關試驗的試劑及器材均見ELISA部分。

            要說明的是,本法為ELISA直接法,所測的工作濃度與在實際應用中的最適濃度可相差幾個滴度。這就要求在建立ELISA實驗系統中,因此基礎上還應進一步確定實際工作濃度(可采用方陣法),以達到最適的實驗條件。

            (四)注意事項

            1.在具備高質量HRP的條件下,所要標記的抗體也要活性高,效價高(最低1∶16),純度高,親和力好,這是保證標記物效價高,免疫活性好的首要條件。

            2.所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴格掌握。所用試劑,最好(或必需)新鮮配制。如在戊二醛標記法中所用戊二醛應為新鮮純品,因戊二醛儲存過久可形成縮和體(雜質)。否則,影響標記效果。

            3.室溫攪拌時須避光,室內溫度一般在25℃為宜。標記物每次透析前,須認真檢查,防止漏液。

            4.濃的標記物相當穩定,常加入30~40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1~2年,但稀釋成1∶10,只能保存數周。已配制的使用液應在12小時內用完。切忌反復凍融。
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