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            平板菌落計數法具體標準步驟

            2024-01-25 10:43 來源:上海遠慕生物試劑
            培養到時間后,計數每個平板上的菌落數??捎萌庋塾^察,必要時用放大鏡檢查,以防遺漏。在記下各平板的菌落總數后,求出同稀釋度的各平板平均菌落數,計算處原始樣品中每克(或每ml)中的菌落數,進行報告。
            操作方法一:

            1.以無菌操作取檢樣25g(或25ml),放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內預置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內,經充分振搖或研磨制成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后,最好置滅菌均質器中以8000~10000r/min的速度處理1min,制成1:10的均勻稀釋液。用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml,沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內,振搖試管混合均勻,制成1:100的稀釋液。另取1ml滅菌吸管,按上項操作順序,制10倍遞增稀釋液,如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。

            2.無菌操作:操作中必須有“無菌操作”的概念,所用玻璃器皿必須是完全滅菌的,不得殘留有細菌或抑菌物質。所用剪刀、鑷子等器具也必須進行消毒處理。樣品如果有包裝,應用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。操作應當在超凈工作臺或經過消毒處理的無菌室進行。瓊脂平板在工作臺暴露15分鐘,每個平板不得超過15個菌落。

            3.采樣的代表性:如系固體樣品,取樣時不應集中一點,宜多采幾個部位。固體樣品必須經過均質或研磨,液體樣品須經過振搖,以獲得均勻稀釋液。

            4.樣品稀釋誤差:為減少樣品稀釋誤差,在連續遞次稀釋時,每一稀釋液應充分振搖,使其均勻,同時每一稀釋度應更換一支吸管。在進行連續稀釋時,應將吸管內液體沿管壁流入,勿使吸管尖端伸入稀釋液內,以免吸管外部粘附的檢液溶于其內。為減少稀釋誤差,SN標準采用取10mL稀釋液,注入90mL緩沖液中。

            5.稀釋液:樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水,有的采用磷酸鹽緩沖液(或0.1%蛋白胨水),后者對食品中已受損傷的細菌細胞有一定的保護作用。如對含鹽量較高的食品(如醬油)進行稀釋,可以采用滅菌蒸餾水。

            操作方法二:

            1.根據標準要求或對污染情況的估計,選擇2~3個適宜稀釋度,分別在制10倍遞增稀釋的同時,以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中,每個稀釋度做兩個平皿。將涼至46℃營養瓊脂培養基注入平皿約15ml,并轉動平皿,混合均勻。同時將營養瓊脂培養基傾入加有1ml稀釋液(不含樣品)的滅菌平皿內作空白對照。待瓊脂凝固后,翻轉平板,置36±1℃溫箱內培養48±2h,取出計算平板內菌落數目,乘以稀釋倍數,即得每克(每毫升)樣品所含菌落總數。

            2.傾注用培養基應在46℃水浴內保溫,溫度過高會影響細菌生長,過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴,應以皮膚感受較熱而不燙為宜。傾注培養基的量規定不一,從12~20ml不等,一般以15ml較為適宜,平板過厚可影響觀察,太薄又易于干裂。傾注時,培基底部如有沉淀物,應將底部棄去,以免與菌落混淆而影響計數觀察。

            3.為使菌落能在平板上均勻分布,檢液加入平皿后,應盡快傾注培養基并旋轉混勻,可正反兩個方向旋轉,檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min,以防止細菌有所死亡或繁殖。。

            4.培養溫度一般為37℃(水產品的培養溫度,由于其生活環境水溫較低,故多采用30℃)。培養時間一般為48h,有些方法只要求24h的培養即可計數。培養箱應保持一定的濕度,瓊脂平板培養48h后,培養基失重不應超過15%。5.為了避免食品中的微小顆?;蚺嗷械碾s質與細菌菌落發生混淆,不易分辨,可同時作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板,不經培養,而于4℃環境中放置,以便計數時作對照觀察。在某些場合,為了防止食品顆粒與菌落混淆不清,可在營養瓊脂中加入氯化三苯四氮唑(TTC),培養后菌落呈紅色,易于分別。

            操作方法三:

            1.培養到時間后,計數每個平板上的菌落數??捎萌庋塾^察,必要時用放大鏡檢查,以防遺漏。在記下各平板的菌落總數后,求出同稀釋度的各平板平均菌落數,計算處原始樣品中每克(或每ml)中的菌落數,進行報告。

            2.到達規定培養時間,應立即計數。如果不能立即計數,應將平板放置于0-4℃,但不得超過24h。

            3.計數時應選取菌落數在30~300之間的平板(SN標準要求為25~250個菌落),若有二個稀釋度均在30~300之間時,按國家標準方法要求應以二者比值決定,比值小于或等于2取平均數,比值大于2則其較小數字(有的規定不考慮其比值大小,均以平均數報告)。

            4.若所有稀釋度均不在計數區間。如均大于300,則取最高稀釋度的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。如均小于30,則以最低稀釋度的平均菌落數乘稀釋倍數報告之。如菌落數有的大于300,有的又小于30,但均不在30~300之間,則應以最接近300或30的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。如所有稀釋度均無菌落生長,則應按小于1乘以最低稀釋倍數報告之。有的規定對上述幾種情況計算出的菌落數按估算值報告。

            5.不同稀釋度的菌落數應與稀釋倍數成反比(同一稀釋度的二個平板的菌落數應基本接近),即稀釋倍數愈高菌落數愈少,稀釋倍數愈低菌落數愈多。如出現逆反現象,則應視為檢驗中的差錯(有的食品有時可能出現逆反現象,如酸性飲料等),不應作為檢樣計數報告的依據。

            6.當平板上有鏈狀菌落生長時,如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限,則應作為一個菌落計,如存在有幾條不同來源的鏈,則每條鏈均應按一個菌落計算,不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數。如有片狀菌落生長,該平板一般不宜采用,如片狀菌落不到平板一半,而另一半又分布均勻,則可以半個平板的菌落數乘2代表全平板的菌落數。

            7.當計數平板內的菌落數過多(即所有稀釋度均大于300時),但分布很均勻,可取平板的一半或1/4計數。再乘以相應稀釋倍數作為該平板的菌落數。

            8.菌落數的報告,按國家標準方法規定菌落數在1~100時,按實有數字報告,如大于100時,則報告前面兩位有效數字,第三位數按四舍五入計算。固體檢樣以克(g)為單位報告,液體檢樣以毫升(ml)為單位報告,表面涂擦則以平方厘米(cm)報告。
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